Verificación de los pequeños ARN codificados por el SARS-CoV-2 y su contribución a la inflamación pulmonar asociada a la infección
El SARS-CoV-2, agente causal de la COVID-19, ha emergido como una amenaza global para la salud debido a su capacidad para inducir complicaciones respiratorias graves e inflamación sistémica. Aunque el virus comparte un 79,2% de identidad de secuencia con el SARS-CoV-1, los mecanismos de patogenicidad, particularmente aquellos que impulsan la inflamación pulmonar, aún no se comprenden completamente. Estudios recientes sobre el SARS-CoV-1 revelaron la producción de pequeños ARN virales (svARN) que exacerban la patología pulmonar. Basándose en este descubrimiento, el presente estudio investiga si el SARS-CoV-2 codifica de manera similar svARN y evalúa su papel en la modulación de las respuestas inflamatorias del huésped durante la infección.
Identificación y verificación de los svARN codificados por el SARS-CoV-2
El estudio comparó inicialmente los diez svARN derivados del SARS-CoV-1 más abundantes con el genoma del SARS-CoV-2 para predecir seis svARN potenciales codificados por el SARS-CoV-2 (Tabla Suplementaria 1). La validación experimental se realizó utilizando muestras clínicas, incluyendo cinco hisopados nasofaríngeos positivos para SARS-CoV-2, dos tejidos pulmonares fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) de pacientes con COVID-19 que se sometieron a trasplante de pulmón, y modelos in vitro que involucran la línea celular epitelial bronquial humana 16HBE. La poliadenilación combinada con la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y la pirosecuenciación confirmaron la existencia de dos svARN—svARN-5p y svARN-3p—en muestras clínicas infectadas y células transfectadas (Figura 1A, B).
La predicción de la estructura secundaria utilizando el servidor web RNAfold sugirió que estos dos svARN se originan a partir del mismo ARN precursor, formando una estructura de horquilla de 66 pares de bases (Figura 1C, Figura Suplementaria 2). La secuencia de este precursor, listada en la Tabla Suplementaria 4, indicó una vía de biogénesis no canónica, ya que los svARN no dependían de la RNasa III, el tipo celular o la especie del huésped, pero se correlacionaban con los niveles de replicación viral. Esta observación coincide con hallazgos previos en el SARS-CoV-1, donde se demostró que los svARN evaden los mecanismos de interferencia de ARN del huésped.
Perfil transcripcional de la inflamación pulmonar asociada a la COVID-19
Para caracterizar el panorama inflamatorio de los pulmones infectados por SARS-CoV-2, se analizaron nueve conjuntos de datos de secuenciación de ARN disponibles públicamente de pacientes con COVID-19 (Tabla Suplementaria 5). Se identificaron 35 genes significativamente regulados al alza en pacientes con COVID-19, formando un perfil de expresión característico (Tabla Suplementaria 6). Los análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) destacaron vías asociadas con la señalización del interferón tipo I (IFN), la actividad de las quimiocinas y la activación de la respuesta inmune (Figura 1E).
Una validación adicional mediante RT-qPCR en tejidos pulmonares FFPE de pacientes con COVID-19 y controles no infectados confirmó la regulación al alza de 16 genes del perfil de 35 genes y 8 genes relacionados con la tormenta de citocinas, incluyendo CXCL5, CXCL9, CXCL11, IFNG, IFNL1 e IL1A (Figura 1F, Tablas Suplementarias 8 y 9). Los análisis de enriquecimiento reiteraron la prominencia de la inmunidad mediada por IFN y la señalización de quimiocinas en la conducción de la inflamación (Figura 1G). Estos hallazgos subrayan la hiperactivación de las vías inmunes innatas en los pulmones de pacientes con COVID-19, consistentes con la tormenta de citocinas observada en casos graves.
Efectos proinflamatorios del precursor de svARN del SARS-CoV-2
Para evaluar el papel funcional de los svARN identificados, se transfectaron células 16HBE con precursores sintéticos de svARN-5p, svARN-3p o un ARN control. Las células transfectadas con el precursor de svARN exhibieron la respuesta inflamatoria más pronunciada, caracterizada por una regulación al alza significativa de CXCL8, CXCL11, IFNA1, IFNB1, IFNG e IFNL1 (Figura 1H). Sorprendentemente, la transfección con los svARN maduros por sí solos no indujo efectos similares, lo que sugiere que la respuesta inflamatoria depende del precursor molecular en lugar de los svARN procesados.
Los análisis GO y KEGG de los genes expresados diferencialmente en las células transfectadas implicaron las vías de IFN tipo I y la señalización mediada por quimiocinas como mecanismos centrales (Figura 1I). Experimentos dependientes del tiempo y la dosis revelaron que los efectos proinflamatorios del precursor de svARN no dependían de la dosis, pero se intensificaban con el tiempo. A las 96 horas post-transfección, se observó una regulación al alza sostenida de CXCL8, CXCL11 e IFNB1, junto con seis genes del perfil de 35 genes de COVID-19: IFI27, EIF2AK2, LY6E, DDX58, BTN3A1 y SERPING1 (Figura 1J, K, Figura Suplementaria 3). Estos resultados sugieren que el precursor de svARN perpetúa la inflamación al amplificar las respuestas de IFN y quimiocinas, contribuyendo potencialmente a la activación inmune prolongada observada en casos graves de COVID-19.
Implicaciones para la patogénesis y la terapéutica del SARS-CoV-2
El estudio destaca dos hallazgos clave:
- El SARS-CoV-2 Codifica svARN Funcionales: La verificación de svARN-5p y svARN-3p en muestras clínicas y modelos celulares confirma que el SARS-CoV-2, al igual que el SARS-CoV-1, produce svARN. Es probable que estas moléculas se deriven de un precursor compartido, posicionándolas cerca de los extremos del genoma viral—un patrón observado en otros virus de ARN.
- El Precursor de svARN Impulsa la Inflamación: La molécula precursora, en lugar de los svARN maduros, activa vías críticas para las respuestas de IFN y quimiocinas. Este mecanismo refleja lo observado en el SARS-CoV-1, donde la inhibición de svARN-N redujo la patología pulmonar, sugiriendo una estrategia conservada entre los coronavirus para manipular la inmunidad del huésped.
La biogénesis de los svARN del SARS-CoV-2 sigue siendo poco clara, pero parece ser independiente de las vías canónicas de interferencia de ARN. Investigaciones adicionales sobre sus mecanismos de producción podrían revelar objetivos terapéuticos. Por ejemplo, la disrupción de la estructura del precursor o la inhibición de su procesamiento podría atenuar la inflamación sin apuntar directamente a la replicación viral—una estrategia que podría complementar las terapias antivirales existentes.
Conclusión
Este estudio proporciona la primera evidencia de los svARN codificados por el SARS-CoV-2 y su contribución a la inflamación pulmonar asociada a la infección. El papel del precursor de svARN en la activación de CXCL8, CXCL11 y las vías de IFN tipo I ofrece nuevas perspectivas sobre la patogénesis de la COVID-19. Estos hallazgos abren el camino para nuevas terapias destinadas a mitigar las respuestas inmunes excesivas, reduciendo potencialmente la morbilidad en casos graves.
doi:10.1097/CM9.0000000000002059