Paired Box 5 Aumenta la Quimiosensibilidad de las Células de Carcinoma Escamoso de Esófago al Promover la Actividad de la Señalización de p53
El cáncer de esófago (CE) representa una preocupación significativa para la salud global, ocupando el sexto lugar como causa de muertes relacionadas con el cáncer. Entre sus subtipos, el carcinoma escamoso de esófago (CEE) es particularmente prevalente en países asiáticos, representando aproximadamente el 90% de todos los casos de CE. A pesar de los avances en tratamientos multimodales como la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, la tasa de supervivencia a 5 años para el CEE sigue siendo baja, situándose en un 20%. Un factor importante que contribuye a este pronóstico desfavorable es la sensibilidad limitada o la resistencia del CEE a muchos agentes quimioterapéuticos. En consecuencia, existe una necesidad urgente de identificar nuevos objetivos moleculares y biomarcadores que puedan predecir la quimiosensibilidad y mejorar los resultados del tratamiento.
Las modificaciones epigenéticas, particularmente la metilación del ADN, desempeñan un papel crucial en la carcinogénesis al silenciar genes supresores de tumores. La hipermethylación de la región promotora ha sido implicada en la inactivación de varios genes supresores de tumores en el CE, incluyendo TFPI-2, RARB, P16INK4a, RASSF1, APC, RUNX3, p14ARF y PRSS8. La investigación de genes regulados por metilación del promotor en el CEE puede revelar nuevos biomarcadores para el diagnóstico y la terapia.
El gen paired box 5 (PAX5), ubicado en el cromosoma 9p13, codifica la proteína Pax-5, que es esencial para la diferenciación de células B y el neurodesarrollo embrionario. PAX5 funciona principalmente como un supresor de tumores, y su inactivación mediante hipermethylación del promotor ha sido observada en varios cánceres, incluyendo el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, el cáncer gástrico, el hepatoma, el cáncer de mama y el cáncer de pulmón. En el CEE, la metilación del promotor de PAX5 se ha asociado con resultados de supervivencia deficientes y una sensibilidad reducida al cisplatino. Sin embargo, el papel preciso de PAX5 en la progresión del CEE sigue siendo poco comprendido.
Este estudio tuvo como objetivo dilucidar el papel de PAX5 en el CEE mediante el examen de su expresión, estado de metilación e impacto funcional en la proliferación celular, la apoptosis y la quimiosensibilidad. La investigación involucró ocho líneas celulares de CEE, 51 muestras de tejido primario de CEE y ocho muestras de mucosa esofágica normal. También se consultó The Cancer Genome Atlas (TCGA) para analizar los datos de expresión y metilación de PAX5.
La metilación del promotor de PAX5 se detectó en el 37.3% (19/51) de las muestras primarias de CEE, asociándose significativamente con la edad y el estadio tumor-nódulo-metástasis (TNM). El análisis de datos de TCGA reveló una correlación inversa entre la expresión de PAX5 y la metilación del promotor. La restauración de la expresión de PAX5 en las líneas celulares de CEE suprimió la proliferación celular, promovió la apoptosis e inhibió el crecimiento tumoral, como se verificó en ratones xenoinjertados. La expresión ectópica de PAX5 aumentó significativamente la actividad de luciferasa del reportero de p53 y elevó los niveles de ARNm y proteína de p53. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina confirmaron una interacción directa de PAX5 con la región promotora de p53. La re-expresión de PAX5 sensibilizó las líneas celulares de CEE KYSE150 y KYSE30 al fluorouracilo y al docetaxel, mientras que el silenciamiento de PAX5 indujo resistencia en las células KYSE450.
Los hallazgos sugieren que PAX5 actúa como un supresor de tumores en el CEE, inhibiendo la proliferación, promoviendo la apoptosis y mejorando la quimiosensibilidad a través de la activación de la vía de señalización de p53. El silenciamiento epigenético de PAX5 contribuye a la progresión del CEE, convirtiéndolo en un objetivo terapéutico potencial y un biomarcador de quimiosensibilidad para el tratamiento del CEE.
Metilación y Expresión de PAX5 en el CEE
El estudio examinó primero el estado de metilación y la expresión de PAX5 en líneas celulares de CEE y tumores primarios. Se utilizaron PCR específica de metilación (MSP) y secuenciación de bisulfito (BSSQ) para analizar la región promotora de PAX5. Se detectó metilación en siete de las ocho líneas celulares de CEE, con metilación completa observada en las células KYSE150, KYSE30 y TE3. La RT-PCR semiquantitativa reveló que la expresión de PAX5 se correlacionó inversamente con la metilación del promotor. El tratamiento con el agente desmetilante 5-aza-2-deoxycytidina (DAC) restauró la expresión de PAX5 en las células KYSE150 y KYSE30, confirmando que la expresión de PAX5 está regulada por la metilación del promotor.
En tejidos primarios de CEE, se observó metilación del promotor de PAX5 en el 37.3% de los casos, asociándose significativamente con una edad más joven y un estadio TNM avanzado. El análisis de datos de TCGA mostró que la expresión de PAX5 se correlacionó negativamente con la metilación del promotor en sitios CpG específicos (cg00464519 y cg02538199). Aunque no se encontró una asociación significativa entre la expresión de PAX5 y la supervivencia global a 5 años (OS), los niveles de metilación del promotor de PAX5 fueron significativamente más altos en los tejidos cancerosos en comparación con los tejidos adyacentes.
Impacto Funcional de PAX5 en la Proliferación y Apoptosis de Células de CEE
Para investigar el papel supresor de tumores de PAX5, se realizaron ensayos de formación de colonias y ensayos MTT. La restauración de la expresión de PAX5 en las células KYSE150 y KYSE30 redujo significativamente el número de colonias y la viabilidad celular. Por el contrario, la eliminación de PAX5 en las células KYSE450 aumentó el número de colonias y la viabilidad celular. Los ensayos de proliferación con bromodeoxiuridina (BrdU) confirmaron que el tratamiento con DAC redujo el porcentaje de células en la fase S del ciclo celular en las células KYSE150 y KYSE30, pero no en las células KYSE450, indicando que PAX5 inhibe la proliferación de células de CEE.
Se utilizaron citometría de flujo y análisis Western blot (WB) para evaluar el efecto de PAX5 en la apoptosis. La restauración de la expresión de PAX5 en las células KYSE150 y KYSE30 aumentó el porcentaje de células apoptóticas y reguló al alza la expresión de caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y PARP clivados. Por el contrario, la eliminación de PAX5 en las células KYSE450 disminuyó la apoptosis y reguló a la baja estos marcadores apoptóticos. Estos resultados sugieren que PAX5 promueve la apoptosis en las células de CEE al activar la cascada de caspasas.
Efecto Supresor de Tumores de PAX5 In Vivo
El efecto supresor de tumores de PAX5 se validó adicionalmente in vivo utilizando modelos de ratones xenoinjertados. Las células KYSE150 y KYSE30 transfectadas de manera estable con PAX5 o un vector vacío se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos. La expresión de PAX5 redujo significativamente el volumen y el peso del tumor en comparación con el grupo de control. Los ensayos TUNEL revelaron un mayor porcentaje de células apoptóticas en los tumores que expresaban PAX5. La tinción inmunohistoquímica (IHC) confirmó que la expresión de PAX5 se correlacionó positivamente con la expresión de p53 en los tumores xenoinjertados, indicando que PAX5 promueve la apoptosis in vivo a través de la vía de señalización de p53.
PAX5 Activa la Vía de Señalización de p53
El estudio exploró el mecanismo por el cual PAX5 ejerce sus efectos supresores de tumores. Los ensayos de reportero de luciferasa dual mostraron que la expresión ectópica de PAX5 aumentó la actividad de luciferasa del reportero de p53 en las células KYSE150 y KYSE30. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) confirmaron que PAX5 se une a la región promotora de p53, indicando que PAX5 regula al alza la expresión de p53 a nivel transcripcional. La RT-PCR cuantitativa demostró que la expresión de PAX5 aumentó significativamente los niveles de ARNm de p53 en las células KYSE150 y KYSE30, mientras que la eliminación de PAX5 en las células KYSE450 redujo los niveles de ARNm de p53. Estos hallazgos sugieren que PAX5 activa la vía de señalización de p53 al unirse directamente al promotor de p53 y mejorar su transcripción.
PAX5 Aumenta la Quimiosensibilidad en Células de CEE
El estudio también investigó el impacto de PAX5 en la quimiosensibilidad de las células de CEE. Se utilizaron ensayos MTT para determinar la concentración inhibitoria media (IC50) de fluorouracilo (5-FU) y docetaxel en células de CEE con o sin expresión de PAX5. La restauración de la expresión de PAX5 en las células KYSE150 y KYSE30 redujo significativamente los valores de IC50 de 5-FU y docetaxel, indicando una mayor quimiosensibilidad. Por el contrario, la eliminación de PAX5 en las células KYSE450 aumentó los valores de IC50, sugiriendo una resistencia inducida a estos agentes quimioterapéuticos.
Para confirmar la participación de la vía de señalización de p53 en la quimiosensibilidad inducida por PAX5, se utilizó el inhibidor de p53 pifithrin-m. El tratamiento con pifithrin-m aumentó los valores de IC50 de 5-FU y docetaxel en las células KYSE150 y KYSE30 que expresaban PAX5, aunque estos valores permanecieron más bajos que en el grupo de control. Estos resultados indican que PAX5 aumenta la quimiosensibilidad en las células de CEE al activar la vía de señalización de p53.
Conclusión
En resumen, PAX5 funciona como un supresor de tumores en el CEE al inhibir la proliferación celular, promover la apoptosis y mejorar la quimiosensibilidad a través de la activación de la vía de señalización de p53. El silenciamiento epigenético de PAX5 contribuye a la progresión del CEE, convirtiéndolo en un objetivo terapéutico potencial y un biomarcador de quimiosensibilidad para el tratamiento del CEE. Los hallazgos de este estudio proporcionan información valiosa sobre los mecanismos moleculares subyacentes al CEE y destacan el potencial de PAX5 como un nuevo objetivo terapéutico.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002018