Análisis de características inmunológicas basado en secuenciación de ARN de una sola célula en un paciente con COVID-19 y recurrencia de ARN positivo para SARS-CoV-2
Desde su aparición en diciembre de 2019, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha infectado a más de 2.400 millones de personas en todo el mundo, causando más de 4,9 millones de muertes. Para comprender la patogénesis de la infección, se han construido perfiles de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con COVID-19 en distintas etapas de la enfermedad. Estos datos mostraron una típica respuesta a interferón y expansión de subtipos de linfocitos T citotóxicos en casos moderados. En pacientes graves con síndrome de dificultad respiratoria aguda, se observó elevación de plasmablastos y un subconjunto no canónico de neutrófilos. Por el contrario, en la fase de recuperación, hubo aumento de células plasmáticas con cambios novedosos en el receptor de células B (BCR).
Un meta-análisis de 5182 pacientes convalecientes reveló una tasa acumulada de positividad recurrente del ARN del 12% (IC del 95%: 12%-13%) tras 1 y 2 meses del alta. Para explorar las características inmunológicas subyacentes, analizamos el paisaje transcriptómico mediante scRNA-seq en PBMC de un paciente convaleciente con recurrencia de ARN positivo en hisopados faríngeos. Mediante PCR cuantitativa, se identificó ARN viral positivo 14 días post-alta, persistiendo por 8 semanas adicionales. Se incluyeron como controles pacientes convalecientes con ARN negativo (n = 15) y fallecidos por COVID-19 (n = 4).
Las características generales de los pacientes se detallan en la Tabla Suplementaria 1. De 20 pacientes analizados, la edad promedio fue 65,1 años (rango: 33–92) y 8 eran mujeres. Según gravedad, 3 fueron clasificados como moderados, 12 graves y 5 críticos. Dado que uno de los pacientes moderados presentó recurrencia viral, se secuenció el BCR en estas células mediante la plataforma 10x. También se secuenció el receptor de linfocitos T (TCR), excluyendo una muestra por baja calidad (Figura 1A).
No se detectaron lecturas virales en las PBMC. Tras procesamiento y control de calidad, se generó un atlas inmunológico con 267.901 transcriptomas celulares (promedio: 14.100 PBMC/muestra). La normalización y agrupamiento identificaron 8 tipos celulares principales: linfocitos T (CD3D, CD3E), B (CD79A), células NK (NKG7, GNLY), monocitos (CD14), células dendríticas derivadas de monocitos (MO-DC; CD1C), células dendríticas plasmacitoides (pDC; IL3RA), células madre hematopoyéticas (CYTL1) y plaquetas (PPBP). Las proporciones de linfocitos B y NK disminuyeron, mientras que linfocitos T, monocitos, MO-DC y pDC aumentaron en el paciente con recurrencia (P ajustado < 0,05).
Mediante la herramienta SingleR, se confirmó la anotación manual de subtipos celulares. Los linfocitos B se clasificaron en pre-B (IL7R+), inmaduros (CD37+), naïve (IGHD+), de memoria (CD27+), plasmáticas (MZB1+) y plasmáticas proliferativas (MKI67+). En el paciente recurrente, las frecuencias de pre-B, inmaduras, naïve y plasmáticas fueron 30,0-, 8,7-, 1,7- y 9,2 veces menores respectivamente, mientras que las células de memoria y plasmáticas proliferativas aumentaron significativamente (Figura 1B-C).
El análisis del repertorio de BCR (2570 células) mostró una menor detección de BCR en el paciente recurrente (56,7% vs 76,4%; P < 0,05). Este presentó expansión clonal limitada, sesgo en la longitud de CDR3 para IGH (P < 0,0001) y pares VJ predominantes distintos (IGKV1-5 ~ IGKJ1 vs IGKV3-20 ~ IGKJ2 en controles). Los niveles plasmáticos de anticuerpos anti-S1S2, anti-RBD y anti-N también fueron inferiores (Figura 1D-F).
El análisis de enriquecimiento génico (GSEA) reveló disminución de la señalización de TLR4, crucial para la activación de linfocitos B, y downregulación de NF-κB en rutas de BCR y receptor Fc-ε en el paciente recurrente (Figura 1G-I). Estos hallazgos sugieren un desarrollo, proliferación y función alterados de linfocitos B, asociados a reducción en las vías de TNF/TNFR, activación de NF-κB e integridad de PLAUR/integrina αMβ2.
En conclusión, nuestro estudio demuestra defectos inmunológicos clave en la recurrencia de COVID-19, particularmente en la maduración y reconocimiento antigénico de linfocitos B, proporcionando insights mecánicos para futuras intervenciones.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001956