Perfiles de Expresión Génica de Células Mononucleares de Sangre Periférica de Pacientes con Dermatitis Atópica Estimuladas con Malassezia globosa
La dermatitis atópica (DA) es un trastorno inflamatorio crónico de la piel caracterizado por respuestas inmunitarias desreguladas. La levadura Malassezia, particularmente Malassezia globosa y Malassezia restricta, ha sido implicada en la patogénesis de la DA debido a su colonización en la piel lesionada. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a su interacción con las células inmunitarias del huésped siguen sin estar claros. Este estudio investigó los cambios transcriptómicos en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con DA y controles sanos tras la estimulación con M. globosa, con el objetivo de elucidar su papel en la desregulación inmunitaria.
Diseño del Estudio y Características de los Participantes
El estudio incluyó a tres pacientes masculinos con DA severa (puntuaciones del índice de área y gravedad del eccema [EASI] >21) y tres controles sanos masculinos de la misma edad. Los pacientes con DA tenían 8, 10 y 12 años, con puntuaciones EASI de 22.7, 24.2 y 55.2, respectivamente. Los controles sanos tenían 8, 9 y 13 años. Los criterios de exclusión incluyeron el uso reciente de glucocorticoides, inmunosupresores, antihistamínicos, medicamentos tópicos, o la presencia de enfermedades cutáneas concurrentes, cáncer o enfermedades sistémicas graves. Se obtuvo la aprobación ética del Comité de Ética de la Facultad de Medicina Clínica y el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Chengdu (No. 2018CYFYHEC-BA-28), adhiriéndose a la Declaración de Helsinki. Todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado.
Aislamiento y Estimulación de las PBMC
Se recolectó sangre periférica (5 mL) de cada participante y se estratificó sobre medio de separación de linfocitos (Hao Yang, Tianjin, China). Tras la centrifugación a 2,000 rpm durante 25 minutos, se extrajo la capa de PBMC, se lavó dos veces y se resuspendió en medio de cultivo (RPMI-1640 con 20% de suero bovino fetal, 100 U/mL de estreptomicina y 100 µg/mL de penicilina) a una densidad de 1 × 10⁶ células/mL. Las células se cultivaron en placas de seis pozos (6 mL/pozo) a 37°C con 5% de CO₂ durante 24 horas. Posteriormente, las células se dividieron en dos grupos: uno tratado con 0.6 mL de suspensión de M. globosa (CBS7874) (1 × 10⁶ células/mL) y el otro con medio de cultivo solo. Después de 48 horas de incubación, las células se centrifugaron, se lisaron con Trizol (Ambion, USA) y se almacenaron a −80°C para la extracción de ARN. Los sobrenadantes se retuvieron para el análisis de citocinas.
Perfiles de Expresión Génica y Análisis de Datos
El perfil de expresión génica se realizó utilizando el arreglo Affymetrix Human Prime View (OE Biotech Co., China). Los genes diferencialmente expresados (DEGs) se identificaron utilizando un cambio de expresión (≥2) y la prueba t (P <0.05). Los datos crudos y analizados se depositaron en el Gene Expression Omnibus (GSE139247). Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional de términos de Ontología Génica (GO) y rutas de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Los niveles de interleucina (IL)-4 e IL-13 en los sobrenadantes se cuantificaron mediante ELISA (Abcam, UK).
Expresión Génica Diferencial en Pacientes con DA vs. Controles Sanos
La estimulación con M. globosa indujo 356 DEGs (188 regulados al alza, 168 regulados a la baja) en las PBMC de pacientes con DA y 110 DEGs (60 regulados al alza, 50 regulados a la baja) en los controles sanos. Solo diez genes superpuestos (8 regulados al alza, 2 regulados a la baja) se compartieron entre los grupos, lo que indica respuestas transcripcionales distintas. El análisis de conglomerados confirmó tendencias de expresión consistentes dentro de cada grupo.
Términos y Rutas Funcionales Enriquecidos en Pacientes con DA
El análisis GO reveló un enriquecimiento significativo en procesos relacionados con la metilación del ADN y la modificación de histonas en pacientes con DA. Las enzimas clave incluyeron DNMT3L (regulado a la baja 2.44 veces) y TDG (regulado al alza 2.46 veces), sugiriendo una regulación epigenética alterada. El análisis de rutas destacó la activación de:
- Ruta del receptor Fc gamma (FcgR): Involucrada en la fagocitosis y la eliminación de complejos inmunitarios.
- Ruta del receptor Fc épsilon (FceRI): Vinculada a la activación de mastocitos y la producción de citocinas Th2.
- Ruta Ras: Regula la endocitosis de monocitos/macrófagos.
- Ruta del receptor tipo NOD (NLR): Media la diferenciación de células T específicas de antígeno.
En contraste, los controles sanos mostraron un enriquecimiento en menos rutas, sin superposición en las rutas de señalización con los pacientes con DA.
Producción de Citocinas y Validación
El ELISA confirmó niveles elevados de IL-4 e IL-13 en los sobrenadantes de las PBMC de pacientes con DA estimuladas con M. globosa, alineándose con los datos transcriptómicos. Esto respalda el papel de M. globosa en la inducción de respuestas inmunitarias polarizadas hacia Th2, una característica de la DA.
Perspectivas Mecanicistas sobre la Desregulación Inmunitaria Inducida por M. globosa
El estudio propone un modelo en el que los antígenos de M. globosa son internalizados por monocitos/macrófagos a través de la endocitosis mediada por FcgR, formando complejos inmunitarios. Estos complejos activan FceRI en los mastocitos, desencadenando la producción dependiente de PI3K de IL-4, IL-5 e IL-13. Simultáneamente, las rutas Ras y NLR mejoran la presentación de antígenos y la activación de células T, amplificando la inflamación. Las modificaciones epigenéticas, como la reducción de la metilación del ADN (regulación a la baja de DNMT3L) y el aumento de la desmetilación (regulación al alza de TDG), pueden desestabilizar aún más la regulación inmunitaria al promover la sobreexpresión de FceRI.
Respuestas Divergentes en DA vs. Controles Sanos
La superposición mínima en los DEGs y las rutas entre los pacientes con DA y los controles subraya el impacto del fondo genético e inmunológico en las interacciones huésped-patógeno. Los pacientes con DA exhiben una mayor sensibilidad a M. globosa, probablemente debido a una desregulación inmunitaria preexistente, mientras que los controles sanos montan una respuesta más contenida.
Conclusión
Este estudio proporciona una visión integral de los efectos transcriptómicos de M. globosa en las PBMC en la DA. Los hallazgos clave incluyen la identificación de rutas que favorecen la polarización hacia Th2, modificadores epigenéticos y mecanismos de detección de patógenos que contribuyen colectivamente a la patogénesis de la DA. Estos resultados resaltan posibles dianas terapéuticas, como la señalización FcgR/FceRI y las enzimas epigenéticas, para modular la inflamación impulsada por Malassezia en la DA.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001512