Neuronas motoras derivadas de células madre pluripotentes inducidas de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) portadoras de diferentes mutaciones de la superóxido dismutasa 1 replican características patológicas de la ELA
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal de progresión rápida, sin tratamientos efectivos disponibles actualmente. La patogénesis exacta de la ELA sigue sin aclararse, aunque los descubrimientos genéticos y moleculares recientes han proporcionado información clave sobre los procesos patológicos comunes subyacentes a la enfermedad. Entre las mutaciones genéticas asociadas a la ELA, las mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa 1 (SOD1) han sido ampliamente estudiadas debido a su identificación temprana y su uso generalizado en modelos murinos. Evidencia sugiere que las mutaciones en SOD1 contribuyen a la ELA mediante propiedades tóxicas como la agregación proteica, la disfunción mitocondrial y la desregulación del calcio. A pesar de los avances significativos en la comprensión de la enfermedad, la traducción de observaciones experimentales en terapias efectivas ha sido desafiante, en parte debido a la falta de modelos celulares humanos que repliquen con precisión los mecanismos de la enfermedad.
Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ofrecen una alternativa prometedora a los modelos tradicionales. Las iPSC derivadas de pacientes con mutaciones genéticas asociadas a la ELA pueden manifestar fenotipos patológicos, proporcionando una herramienta valiosa para estudiar mecanismos de la enfermedad e identificar dianas terapéuticas. En este estudio, se generaron iPSC a partir de dos pacientes con ELA familiar (ELA-F) portadores de mutaciones distintas en SOD1 (SOD1-V14M y SOD1-C111Y), que luego se diferenciaron en neuronas motoras (NM). El objetivo fue explorar la expresión de la proteína SOD1 mutante en estas NM, investigar los niveles intracelulares de calcio y evaluar la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) durante la diferenciación. Los hallazgos demuestran que las NM derivadas de iPSC de pacientes replican aspectos clave de la patogénesis de la ELA, ofreciendo un modelo celular humano para estudiar mecanismos de la enfermedad y explorar terapias potenciales.
Introducción
La ELA se caracteriza por la degeneración progresiva de neuronas motoras, lo que conduce a debilidad muscular, parálisis y muerte. Aunque la mayoría de los casos son esporádicos (ELA-S), aproximadamente el 10% son familiares (ELA-F), con mutaciones en SOD1 como una de las causas más comunes de ELA-F. SOD1 es una enzima crucial en la protección celular contra el estrés oxidativo, al convertir radicales superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Las mutaciones en SOD1 promueven la formación de agregados proteicos tóxicos, disfunción mitocondrial y alteraciones en la homeostasis del calcio, procesos que contribuyen a la degeneración de las neuronas motoras.
A pesar de investigaciones exhaustivas, los mecanismos precisos por los cuales las mutaciones en SOD1 causan ELA permanecen incompletamente entendidos. Los modelos animales, particularmente ratones transgénicos que expresan SOD1 mutante, han sido fundamentales para estudiar la ELA. Sin embargo, estos modelos no replican completamente la complejidad de la ELA humana, subrayando la necesidad de modelos basados en células humanas. Las iPSC derivadas de pacientes con ELA ofrecen una oportunidad única para estudiar la enfermedad en contexto humano, ya que pueden diferenciarse en tipos celulares afectados, como las neuronas motoras.
Métodos
El estudio se realizó siguiendo la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Tercero de la Universidad de Pekín. Se obtuvo consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Se recolectaron fibroblastos cutáneos de dos pacientes con ELA-F portadores de mutaciones SOD1-V14M y SOD1-C111Y, y de cuatro controles sanos. Los fibroblastos se reprogramaron en iPSC utilizando vectores retrovirales que codifican los factores de Yamanaka (OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC). Las iPSC se diferenciaron en neuronas motoras mediante un protocolo modificado que incluyó formación de cuerpos embrioides y exposición a ácido retinoico y sonic hedgehog (SHH).
La pluripotencia de las iPSC se confirmó mediante la expresión de marcadores de pluripotencia (SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81, Nanog, OCT3/4 y SOX2), secuenciación genómica con bisulfito y formación de teratomas en ratones inmunodeficientes. La diferenciación en neuronas motoras se verificó mediante tinción por inmunofluorescencia para marcadores específicos (TUJ1, HB9 e ISL1). Los niveles de proteína SOD1 se midieron mediante Western blot, los niveles de calcio intracelular con el colorante fluorescente Fluo 3-AM, y la actividad de LDH mediante un kit comercial.
Resultados
Las iPSC de los pacientes con ELA-F se diferenciaron exitosamente en neuronas motoras que expresaron marcadores específicos. No hubo diferencias significativas en el número de neuronas motoras HB9- o ISL1-positivas entre pacientes y controles, indicando que las mutaciones en SOD1 no afectaron la capacidad de diferenciación.
El análisis de los niveles de SOD1 reveló que tanto las iPSC como las neuronas motoras derivadas de pacientes presentaron niveles elevados de SOD1 en comparación con los controles, coincidiendo con la hipótesis de acumulación de SOD1 mutante en las neuronas motoras. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la actividad de LDH entre grupos, sugiriendo que las mutaciones no aumentaron la muerte celular durante la diferenciación.
Las mediciones de calcio intracelular mostraron niveles significativamente mayores en las neuronas motoras de pacientes, respaldando la idea de que la desregulación del calcio es un rasgo clave en la ELA. Este aumento podría relacionarse con disfunción mitocondrial, dada la importancia de las mitocondrias en la homeostasis del calcio.
Discusión
Este estudio demuestra que las neuronas motoras derivadas de iPSC de pacientes con ELA-F portadores de mutaciones en SOD1 replican características patológicas clave, como acumulación de SOD1 y desregulación del calcio. Estos hallazgos respaldan el uso de modelos celulares humanos para estudiar mecanismos de la ELA y probar intervenciones terapéuticas.
La elevación de SOD1 en neuronas motoras coincide con estudios previos que vinculan los agregados de SOD1 mutante con toxicidad neuronal. Además, la alteración en los niveles de calcio subraya su papel en la degeneración de las neuronas motoras, posiblemente mediada por estrés oxidativo y disfunción mitocondrial. Estos resultados sugieren que modular la homeostasis del calcio podría ser una estrategia terapéutica prometedora.
Las limitaciones incluyen el tamaño reducido de la muestra y el enfoque en dos mutaciones específicas de SOD1. Futuros estudios deberían ampliar el número de pacientes y explorar otras mutaciones asociadas a la ELA.
Conclusión
En conclusión, las neuronas motoras derivadas de iPSC de pacientes con ELA-F portadores de mutaciones en SOD1 replican características patológicas clave de la ELA, incluyendo acumulación de SOD1 y desregulación del calcio. Este modelo celular humano representa una herramienta valiosa para investigar mecanismos de la enfermedad y desarrollar terapias. Los resultados enfatizan el papel crítico de la homeostasis del calcio en la patogénesis de la ELA y abren vías para explorar estrategias terapéuticas dirigidas a estos procesos.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001693