La Heparina No Fraccionada Atenúa la Disfunción de la Barrera Endotelial a través de la Vía de la Fosfatidilinositol-3 Quinasa/Serina/Treonina Quinasa/Factor Nuclear Kappa-B
La lesión pulmonar aguda (LPA) es una condición crítica caracterizada por una inflamación excesiva en los pulmones, lo que conduce a una alta morbilidad y mortalidad. A pesar de extensas investigaciones, las terapias efectivas para la LPA siguen siendo limitadas. Una característica clave de la LPA es la disrupción de la barrera endotelial pulmonar, lo que resulta en hiperpermeabilidad vascular y edema pulmonar. Las uniones adherentes basadas en la cadherina endotelial vascular (VE-cadherina) desempeñan un papel crucial en la regulación de la permeabilidad endotelial. El lipopolisacárido (LPS), un componente de las bacterias gramnegativas, induce hiperpermeabilidad endotelial al interrumpir las uniones celulares mediadas por VE-cadherina. La heparina no fraccionada (HNF), un anticoagulante comúnmente utilizado, ha demostrado mejorar la función de la barrera endotelial, pero los mecanismos subyacentes no se comprenden completamente. Este estudio investiga los efectos protectores de la HNF sobre la disfunción de la barrera endotelial inducida por LPS y explora la participación de la vía de señalización de la fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K)/serina/treonina quinasa (Akt)/factor nuclear kappa-B (NF-κB).
Métodos
Estudios en Animales
Se dividieron ratones macho C57BL/6 en tres grupos: vehículo, LPS y LPS + HNF. El LPS (30 mg/kg) se administró por vía intraperitoneal para inducir sepsis. Los ratones en el grupo LPS + HNF recibieron una inyección subcutánea de 8 U de HNF 30 minutos antes de la administración de LPS. Se recolectó tejido pulmonar seis horas después de la inyección de LPS para evaluar la lesión pulmonar utilizando la relación peso húmedo/seco (W/D) del pulmón y el análisis histológico. Se analizó el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) para determinar la concentración de proteínas, el recuento total de células, el porcentaje de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) y los niveles de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α).
Cultivo Celular y Tratamiento
Se cultivaron células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC) y se trataron con LPS (10 µg/mL) o TNF-α (10 ng/mL) para inducir disfunción de la barrera endotelial. Se añadió HNF (10 U/mL) 30 minutos antes de la estimulación con LPS o TNF-α. Se realizaron ensayos de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y permeabilidad de fluoresceína isotiocianato-dextrano (FITC-dextrano) para medir la función de la barrera endotelial. Se utilizaron tinción de inmunofluorescencia y análisis de Western blot para evaluar la expresión de VE-cadherina, p120-catenina, cadena ligera de miosina fosforilada (p-MLC) y la remodelación de F-actina. La activación de la vía PI3K/Akt/NF-κB se evaluó midiendo la fosforilación de Akt, la quinasa IκB (IKK) y la translocación nuclear de NF-κB.
Resultados
La HNF Atenúa la Disfunción de la Barrera Endotelial Inducida por LPS In Vivo
El análisis histopatológico reveló que el LPS indujo una lesión pulmonar significativa, incluyendo infiltración de neutrófilos, efusión de eritrocitos, colapso alveolar y engrosamiento septal. La pretratamiento con HNF redujo notablemente estos cambios patológicos. La relación W/D del pulmón, una medida del edema pulmonar, fue significativamente menor en el grupo LPS + HNF en comparación con el grupo LPS (5.05 ± 0.18 vs. 6.93 ± 0.20, P = 0.0022). La HNF también disminuyó la concentración de proteínas (0.32 ± 0.04 vs. 0.57 ± 0.04 mg/mL, P = 0.0092), el recuento total de células (3.65 ± 0.78 vs. 9.57 ± 1.23 × 10^5/mL, P = 0.0155), el porcentaje de PMN (22.20% ± 3.92% vs. 88.05% ± 2.88%, P = 0.0002) y los niveles de TNF-α (189.33 ± 14.19 vs. 460.33 ± 23.48 pg/mL, P = 0.0006) en el BALF. El análisis de Western blot mostró que la HNF previno la disminución inducida por LPS en la expresión de membrana de VE-cadherina y p120-catenina en el tejido pulmonar.
La HNF Reduce la Hiperpermeabilidad Inducida por LPS o TNF-α In Vitro
El LPS y el TNF-α redujeron significativamente el TEER y aumentaron la permeabilidad de FITC-dextrano en HPMEC, lo que indica disfunción de la barrera endotelial. La pretratamiento con HNF aumentó el TEER (LPS + HNF: 15.84 ± 1.09 vs. LPS: 8.90 ± 0.66 V·cm², P = 0.0056; TNF-α + HNF: 18.15 ± 0.98 vs. TNF-α: 11.28 ± 0.64 V·cm², P = 0.0042) y disminuyó la permeabilidad de FITC-dextrano (LPS + HNF: 39.70 ± 1.98 vs. LPS: 56.25 ± 1.51, P = 0.0027; TNF-α + HNF: 36.51 ± 1.20 vs. TNF-α: 55.42 ± 1.42, P = 0.0005). La tinción de inmunofluorescencia y el análisis de Western blot revelaron que la HNF previno la disminución inducida por LPS o TNF-α en la expresión de membrana de VE-cadherina y p120-catenina, redujo la expresión de p-MLC e inhibió la remodelación de F-actina.
La HNF Inhibe la Activación de la Vía PI3K/Akt/NF-κB Inducida por LPS
La estimulación con LPS aumentó la fosforilación de Akt e IKK y promovió la translocación nuclear de NF-κB en HPMEC. La pretratamiento con HNF redujo significativamente la expresión de p-Akt (LPS + HNF: 0.466 ± 0.035 vs. LPS: 0.977 ± 0.081, P = 0.0045), p-IKK (LPS + HNF: 0.578 ± 0.044 vs. LPS: 1.023 ± 0.070, P = 0.0060) y la translocación nuclear de NF-κB (LPS + HNF: 0.503 ± 0.065 vs. LPS: 1.003 ± 0.077, P = 0.0078). Se observaron efectos similares con el inhibidor de PI3K wortmannin, lo que sugiere que los efectos protectores de la HNF están mediados por la vía PI3K/Akt/NF-κB.
Discusión
Este estudio demuestra que la HNF atenúa la disfunción de la barrera endotelial inducida por LPS al estabilizar la VE-cadherina e inhibir la vía de señalización PI3K/Akt/NF-κB. Las uniones adherentes basadas en VE-cadherina son críticas para mantener la integridad de la barrera endotelial. El LPS y el TNF-α interrumpen estas uniones al inducir la internalización de VE-cadherina, lo que conduce a la hiperpermeabilidad endotelial. La HNF previene esta disrupción al mantener la expresión de membrana de VE-cadherina y p120-catenina, reducir la expresión de p-MLC e inhibir la remodelación de F-actina.
La vía PI3K/Akt/NF-κB desempeña un papel central en la regulación de la función de la barrera endotelial. El LPS activa esta vía, lo que conduce a un aumento en la fosforilación de Akt e IKK y la translocación nuclear de NF-κB, lo que promueve la inflamación y el daño endotelial. La HNF inhibe esta vía, reduciendo así la hiperpermeabilidad endotelial y la inflamación. Los hallazgos son consistentes con estudios previos que muestran que la HNF atenúa la secreción de interleucina-8 (IL-8) inducida por LPS y la disfunción de la barrera endotelial a través de la vía PI3K/Akt/NF-κB.
En conclusión, la HNF protege contra la disfunción de la barrera endotelial inducida por LPS al estabilizar la VE-cadherina e inhibir la vía PI3K/Akt/NF-κB. Estos hallazgos sugieren que la HNF puede tener potencial terapéutico para la LPA y otras condiciones caracterizadas por la disrupción de la barrera endotelial. Estudios futuros deberían explorar los efectos de la HNF en entornos clínicos e investigar su potencial como tratamiento para la LPA.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000905