La actividad de los sinoviocitos similares a fibroblastos en la artritis reumatoide se ve afectada por siRNA dirigido a Dickkopf-1
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica sistémica que afecta principalmente las articulaciones periféricas, provocando destrucción articular y discapacidad funcional. La sinovitis crónica, caracterizada por la proliferación de células de la membrana sinovial, es un sello distintivo de la AR. Estas células son una fuente importante de quimiocinas y citocinas asociadas con la inflamación, lo que resulta en la destrucción del cartílago articular y tejidos óseos. Los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLS), células mesenquimales residentes de las articulaciones sinoviales, desempeñan un papel crucial en la patogénesis de la AR. Los FLS activados producen una amplia gama de mediadores solubles y de superficie celular que reclutan, retienen y activan células inmunitarias, generando una expresión desregulada de citocinas proinflamatorias.
La vía de señalización Wnt es un regulador clave del remodelado articular. Dickkopf-1 (DKK-1), un factor secretado endógeno, actúa como antagonista de esta vía al unirse al correceptor LRP5/6 de Wnt. DKK-1 es secretado por los FLS en respuesta a la inflamación y se ha propuesto como un regulador maestro del remodelado óseo en artritis inflamatoria. Estudios previos demuestran que los niveles séricos de DKK-1 están significativamente elevados en pacientes con AR en comparación con controles sanos o individuos con otras enfermedades reumáticas, como osteoartritis y espondilitis anquilosante. El bloqueo de DKK-1 con un anticuerpo anti-DKK-1 ha demostrado revertir el patrón destructivo óseo en modelos experimentales de artritis e inducir un patrón osteoformativo. Sin embargo, se desconoce si el silenciamiento de DKK-1 mediante ARN pequeños de interferencia (siRNA) tiene el mismo efecto que el uso de anticuerpos.
En este estudio, investigamos el efecto del silenciamiento de DKK-1 mediante siRNA en FLS de pacientes con AR. Aislamos FLS de tejidos sinoviales obtenidos durante cirugías de reemplazo de rodilla. Los tejidos se lavaron, fragmentaron e incubaron con colagenasa para obtener una suspensión celular, la cual se cultivó en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino (FBS) y antibióticos. Las células no adherentes se eliminaron mediante lavados, y los FLS se purificaron mediante pases sucesivos.
Para evaluar el silenciamiento de DKK-1, se transfectaron siRNA dirigidos a DKK-1 en FLS utilizando Lipofectamina 2000. Se sintetizaron seis dúplex de siRNA (D1–D6), seleccionando los más efectivos según su capacidad para inhibir la expresión de DKK-1 a nivel de ARNm y proteína. Los niveles de DKK-1 se cuantificaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real y ELISA. Además, se midieron los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, MMP2, MMP3, MMP9, TGF-β1, TGF-β2 y MCP-1 en el sobrenadante de cultivo. Los efectos de los siRNA sobre la invasión y proliferación de FLS se evaluaron mediante ensayos de invasión e incorporación de ³H-timidina, respectivamente. Mediante western blot se analizó la expresión de NF-κB, IRAK1, ERK1, JNK y β-catenina.
Los resultados mostraron que los siRNA dirigidos a DKK-1 inhibieron significativamente su expresión en FLS. Los siRNA D2 y D6, los más efectivos, indujeron una reducción notable en los niveles de IL-6, IL-8, MMP2, MMP3 y MMP9, además de suprimir la proliferación e invasión de FLS. Moléculas clave de señalización proinflamatoria, como IRAK1 y ERK1, disminuyeron tras el silenciamiento de DKK-1. Por el contrario, β-catenina, molécula efectora de la vía Wnt, aumentó.
Al simular un entorno inflamatorio con TNF-α, observamos que este estimula la producción de IL-6, IL-8 y MMPs en FLS, así como su proliferación e invasión. Los siRNA dirigidos a DKK-1 inhibieron estas respuestas, incluso bajo estimulación con TNF-α. Sin embargo, el anticuerpo anti-DKK-1 no reprodujo los mismos efectos.
La capacidad invasiva de los FLS en AR se correlaciona con la gravedad de la enfermedad y el daño radiográfico. Nuestros datos indican que la reducción de DKK-1 disminuye la producción de MMPs y la invasividad de los FLS, sugiriendo que los siRNA contra DKK-1 podrían bloquear directamente la destrucción ósea en AR.
La activación de FLS en AR también implica la síntesis de moléculas proinflamatorias que activan vías como NF-κB y MAPK. Entre las MAPK, ERK y JNK regulan la expresión de MMPs y median la destrucción articular en modelos experimentales. Los siRNA contra DKK-1 redujeron la expresión de ERK y MMPs, lo que sugiere un efecto modulador sobre la vía MAPK.
Estudios previos indican que IRAK-1 suprime la secreción de IL-6/IL-8. En este trabajo, la downregulación de IRAK-1 mediada por siRNA contra DKK-1 podría explicar la disminución de estas citocinas. Además, la interferencia de DKK-1 aumentó los niveles de β-catenina, reforzando su papel como inhibidor natural de la señalización Wnt.
Entre las limitaciones, destacamos la ausencia de experimentos in vivo debido a dificultades técnicas relacionadas con la administración y estabilidad de siRNA. Futuros estudios deberán abordar estos desafíos.
En conclusión, los siRNA dirigidos a DKK-1 inhibieron la proliferación, invasión y respuestas inflamatorias de los FLS, efectos mediados por las vías de ERK e IRAK-1. Estos hallazgos respaldan el silenciamiento de DKK-1 como una estrategia terapéutica prometedora para la AR.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000697