Identificación y caracterización de un nuevo grupo de transcriptos naturales antisentido del locus génico RNA1.2 del citomegalovirus humano
Los transcriptos naturales antisentido (NATs, por sus siglas en inglés) son moléculas de ARN transcritas a partir de la cadena complementaria de ADN de genes anotados. Estos transcriptos desempeñan roles significativos en la regulación de la expresión génica en etapas pretrancriptionales, transcripcionales y postranscripcionales. A pesar de su presencia generalizada en diversas especies, la transcripción antisentido del locus génico RNA1.2 del citomegalovirus humano (HCMV) no había sido investigada previamente. Este estudio tuvo como objetivo identificar y caracterizar los NATs del locus RNA1.2 en una cepa clínica de HCMV.
El HCMV, miembro de la familia de los betaherpesvirus, posee un genoma de 230 a 240 kilobases. La infección por HCMV suele ser asintomática en individuos sanos, pero puede causar complicaciones graves en pacientes inmunocomprometidos y neonatos. El virus codifica diversos ARN, incluidos ARN no codificantes (ncRNAs), los cuales son cruciales en su ciclo de vida y en la evasión de respuestas inmunitarias. Entre estos, RNA1.2 es uno de los transcriptos virales más abundantes, representando una fracción significativa del ARN viral poliadenilado. Aunque se considera principalmente un ARN no codificante largo (lncRNA), evidencia reciente sugiere que también podría codificar un péptido.
En este estudio, se empleó secuenciación de ARN de alto rendimiento con especificidad de cadena para identificar posibles transcriptos antisentido (ASTs) del locus RNA1.2. Se extrajo ARN de fibroblastos de pulmón embrionario humano (HELFs) infectados con la cepa clínica HAN de HCMV. Los datos de RNA-seq se analizaron y visualizaron mediante el software Integrative Genomics Viewer (IGV). Para confirmar la presencia de estos transcriptos, se realizaron Northern blot y amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE).
El análisis de RNA-seq reveló transcripción desde la cadena opuesta del locus RNA1.2, indicando la presencia de NATs. Se caracterizaron tres ASTs distintos, denominados RNA1.2 AST1, RNA1.2 AST2 y RNA1.2 AST3. Estos transcriptos, orientados desde la cadena complementaria del locus RNA1.2, se expresaron predominantemente durante la fase tardía de la infección. Sus extremos 5′ y 3′ se localizaron dentro de la secuencia opuesta al gen RNA1.2 predicho.
El Northern blot confirmó la presencia de estos NATs, detectando tres bandas de aproximadamente 1100, 1000 y 600 nucleótidos en muestras de ARN obtenidas a las 72 horas postinfección (hpi). No se observaron bandas en muestras de 24 hpi, 48 hpi o en células no infectadas, lo que sugiere una inducción específica durante la fase tardía. Además, se detectó un transcrito de ~1.2 kilobases con una sonda específica para RNA1.2, confirmando la transcripción de la cadena sentido.
Los análisis de RACE determinaron los extremos precisos de los RNA1.2 ASTs. Los resultados de 3′-RACE mostraron dos bandas predominantes de ~400 y 250 pares de bases (pb), con extremos 3′ localizados en las posiciones nucleotídicas 8062-8093 y 7843-7855, aguas abajo de una señal de poliadenilación consenso (AATAAA) en las posiciones 7843-7848. El 5′-RACE identificó tres bandas de ~500, 350 y 250 pb, indicando que los RNA1.2 ASTs se inician en las posiciones 7479, 7331 y 7203 del genoma de HCMV HAN, aguas abajo de una caja «TATA» putativa en la posición 7074.
Este estudio identificó al menos tres RNA1.2 ASTs distintos, con diferentes extremos 5′ y 3′. Estos transcriptos, clasificados como NATs internos al estar completamente cubiertos por el transcrito sentido de RNA1.2, son poliadenilados y se localizan en el citoplasma, donde podrían interactuar con ARN sentido superpuestos para regular la expresión génica. La abundancia de los RNA1.2 ASTs fue significativamente menor que la de RNA1.2, consistente con la observación general de que los NATs suelen ser menos abundantes que sus contrapartes sentido.
Los sitios de terminación diferencial de los RNA1.2 ASTs sugieren mecanismos regulatorios complejos. Mientras RNA1.2 AST3 termina en una señal de poliadenilación canónica, RNA1.2 AST1 y AST2 lo hacen más de 250 nucleótidos aguas abajo, lo que podría indicar transcripción de «lectura continua» (read-through), un fenómeno observado en otros herpesvirus. Los sitios de inicio de los ASTs, ubicados aguas abajo de una caja «TATA», junto con un alto contenido de CG en la región upstream del sitio de inicio de transcripción (TSS) de RNA1.2 AST1, sugieren la participación de distintos mecanismos regulatorios.
En conclusión, este estudio caracterizó un nuevo grupo de NATs del locus RNA1.2 de HCMV, los cuales podrían modular la expresión de RNA1.2 durante el ciclo viral. Estos hallazgos establecen una base para investigaciones futuras sobre las funciones biológicas de estos transcriptos y su relevancia en la patogénesis del HCMV.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000299