Identificación de un nuevo coronavirus causante de neumonía grave en humanos: un estudio descriptivo
Introducción
Los coronavirus (CoVs) son virus envueltos con un genoma de ARN monocatenario positivo, que generalmente varía entre 26 y 32 kilobases. Pertenecen a la subfamilia Orthocoronavirinae (familia Coronaviridae) y se clasifican en cuatro géneros: Alphacoronavirus (α), Betacoronavirus (β), Gammacoronavirus (γ) y Deltacoronavirus (δ). El genoma codifica cuatro proteínas estructurales: espiga (S), envoltura (E), membrana (M) y nucleocápside (N), además de proteínas no estructurales y accesorias.
Seis CoVs infectan a humanos: dos α-CoV (229E y NL63) y cuatro β-CoV (OC43, HKU1, SARS-CoV y MERS-CoV). Todos son zoonóticos, con murciélagos como reservorios clave. Desde el siglo XXI, dos CoVs zoonóticos, SARS-CoV (2003: 8.096 casos, 774 muertes) y MERS-CoV (2012: 2.494 casos, tasa de letalidad 34,4%), han causado enfermedades graves.
Métodos
Aprobación ética
El estudio fue aprobado por la Comisión Nacional de Salud de China y la Comisión Ética del Hospital Jinyintan de Wuhan (No. KY-2020-01.01). El consentimiento informado se omitió debido al contexto de emergencia.
Recolección de muestras y datos
Se recolectaron muestras de lavado broncoalveolar (BAL) de cinco pacientes con neumonía hospitalizados en Wuhan (18-29 de diciembre de 2019). Se registraron datos clínicos, demográficos, antecedentes, signos, radiografías torácicas, laboratorios, exposición animal y desenlaces.
Secuenciación genómica
Los ácidos nucleicos se extrajeron con Direct-zol RNA Miniprep kit y Trizol LS. Las bibliotecas se secuenciaron en plataforma Illumina NextSeq. Se aplicaron controles de calidad, eliminación de lecturas de baja complejidad, adaptadores, baja calidad, cortas, del huésped y ribosomales. La asignación taxonómica se realizó con Kraken 2.
Análisis filogenético
El alineamiento múltiple se realizó con ClustalW en MEGA. Los árboles filogenéticos se construyeron por máxima verosimilitud. Las secuencias se depositaron en GISAID (No. EPI_ISL_402123, EPI_ISL_403928-31) y el National Genomics Data Center.
Aislamiento viral
Las muestras de BAL se inocularon en células Vero. La presencia de efecto citopático (CPE) se observó diariamente. Las partículas virales se tiñeron con ácido fosfotúngstico y se visualizaron por microscopía electrónica. Los ácidos nucleicos se confirmaron por RT-PCR.
Inmunofluorescencia
Se prepararon laminillas con células infectadas o no infectadas, fijadas con paraformaldehído y teñidas con suero de convalecientes o controles. Se utilizó anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluoresceína.
Resultados
Información general de los pacientes
Cinco pacientes (41-65 años) presentaron fiebre, tos y disnea. Tres tuvieron exposición al mercado de mariscos de Huanan. Todos desarrollaron síndrome de dificultad respiratoria aguda. Un paciente falleció. Las radiografías mostraron opacidades difusas y consolidación.
Identificación del nuevo CoV por secuenciación
Se identificó una nueva cepa de β-CoV en todos los pacientes, con identidad nucleotídica del 99,8-99,9% entre aislamientos. El virus mostró 79,0% de identidad con SARS-CoV y 51,8% con MERS-CoV. Filogenéticamente, fue más cercano a un CoV similar a SARS de murciélago (SL-ZC45: 87,6-87,7% de identidad), pero en un clado separado.
Análisis filogenético
El nuevo CoV presenta un marco de lectura abierto (ORF8) intacto, característico de CoVs de murciélago. El dominio de unión al receptor se asemeja al de SARS-CoV, sugiriendo uso del mismo receptor.
Cultivo viral
Se observó CPE en 30% de células Vero tras dos pases. La microscopía electrónica reveló partículas virales con proyecciones superficiales. La inmunofluorescencia confirmó la presencia del virus.
Características clínicas y desenlaces
Los pacientes presentaron opacidades en vidrio esmerilado bilateral. Las complicaciones incluyeron shock séptico y lesión renal aguda. Un paciente fue dado de alta y tres permanecieron hospitalizados.
Discusión
La identificación de un nuevo CoV de murciélago asociado a enfermedad respiratoria grave subraya su amenaza potencial. Su similitud en el dominio de unión al receptor con SARS-CoV sugiere mecanismos de entrada similares. La ausencia de síntomas respiratorios altos requiere estudiar la distribución del receptor en órganos. Es crucial detectar infecciones leves o subclínicas mediante ensayos serológicos para controlar la transmisión.
En conclusión, este nuevo CoV representa un riesgo para la salud pública. Es urgente esclarecer su origen y modo de transmisión para prevenir epidemias.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000722