Estructura Bioimpresa Tridimensional Encapsulada con Células Uroteliales: Una Nueva Técnica de Construcción para Parches de Tracto Urinario Ingenierizados por Tejidos
La reconstrucción del tracto urinario sigue siendo un desafío significativo en urología, particularmente debido a la falta de biomateriales adecuados para reemplazar tejidos dañados o defectuosos. Los métodos tradicionales de reconstrucción suelen depender de autoinjertos, como mucosa bucal o prepucio, que, aunque efectivos, presentan limitaciones como morbilidad en el sitio donante y disponibilidad limitada. Esto ha impulsado la exploración de la ingeniería tisular como alternativa viable. Sin embargo, los enfoques convencionales enfrentan desafíos como viabilidad celular comprometida, distribución celular desigual y tiempos de preparación prolongados. En este estudio, presentamos una técnica novedosa que combina bioimpresión tridimensional (3D) e ingeniería tisular para fabricar un parche de tracto urinario, abordando estas limitaciones y ofreciendo una solución prometedora.
Antecedentes y Motivación
Las estenosis del tracto urinario, causadas por cateterización, trauma o infección, frecuentemente requieren intervención quirúrgica. La falta de materiales autólogos ha llevado a la exploración de biomateriales naturales y sintéticos. Los biomateriales naturales, como la submucosa intestinal y la matriz acelular de vejiga (BAM), ofrecen biocompatibilidad pero enfrentan problemas como transmisión de enfermedades y heterogeneidad. Los biomateriales sintéticos, como ácido poliglicólico y ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA), proporcionan soporte estructural pero carecen de señales moleculares para la adhesión celular, comprometiendo la actividad y proliferación celular. Ambos tipos luchan por lograr una distribución espacial celular óptima, crucial para la función tisular.
Los métodos tradicionales de ingeniería tisular implican sembrar células en biomateriales porosos y esperar su infiltración, un proceso que puede tomar semanas. Este tiempo prolongado dificulta la producción de parches «listos para usar». La bioimpresión 3D, derivada de la manufactura aditiva, permite construir andamios con células en un solo paso, controlando precisamente su distribución y forma.
Métodos
Cultivo y Caracterización Celular
Células madre derivadas de tejido adiposo humano (hADSCs) se cultivaron y caracterizaron mediante citometría de flujo para confirmar su fenotipo mesenquimal. Las células fueron positivas para CD44 y CD105 (marcadores mesenquimales) y negativas para CD45 y CD34 (marcadores hematopoyéticos). Las hADSCs se indujeron a diferenciarse en células similares a músculo liso usando medio de diferenciación con factor de crecimiento transformante-beta1 (TGF-β1). Los microtejidos resultantes (MTs) se compararon con microtejidos no inducidos (NI-MTs) en expresión proteica y potencial de diferenciación.
Bioimpresión 3D
Los microtejidos inducidos (ID-MTs) se embebieron en un hidrogel de gelatina y alginato de sodio, bioimprimiéndose con una bioimpresora 3D de microextrusión. Las estructuras se entrecruzaron con cloruro de calcio y cultivaron en medio de diferenciación. Posteriormente, se implantaron subcutáneamente en ratones nude durante una semana para permitir encapsulación y maduración.
Análisis Histológico e Inmunofluorescente
Tras la recuperación, las estructuras encapsuladas se analizaron con tinción de hematoxilina-eosina (H&E), tricrómico de Masson e inmunofluorescencia. H&E reveló la morfología de MTs y hADSCs. El tricrómico de Masson identificó colágeno y fibras musculares lisas. La inmunofluorescencia para CD31 y alfa-actina de músculo liso (α-SMA) evaluó vascularización, mientras que la inmunohistoquímica (IHC) evaluó marcadores de músculo liso (α-SMA y smoothelina) e interleucina-2 (IL-2).
Siembra de Células Uroteliales
Células uroteliales humanas (UCs) se aislaron de tejido ureteral y cultivaron. Las UCs se sembraron en las estructuras bioimpresas encapsuladas y se cultivaron durante una semana. La morfología y distribución se evaluaron mediante inmunofluorescencia de citoqueratinas AE1/AE3.
Resultados
Expresión Proteica en hADSCs y MTs
El análisis por Western blot mostró que la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA) y el gen-6 estimulado por TNF (TSG-6) fue significativamente mayor en MTs que en hADSCs en monocapa. La expresión relativa de VEGFA fue 0.355 ± 0.038 en hADSCs vs. 0.649 ± 0.150 en MTs (t = 3.291, P = 0.030), y TSG-6 fue 0.492 ± 0.092 vs. 1.256 ± 0.401 (t = 3.216, P = 0.032). Estos resultados sugieren que los MTs tienen mayor potencial para vascularización y efectos antiinflamatorios.
Hallazgos Histológicos e Inmunofluorescentes
H&E mostró que los MTs mantuvieron su morfología post-bioimpresión e implantación, mientras que las hADSCs adoptaron forma redondeada. El tricrómico de Masson reveló que los ID-MTs produjeron colágeno y fibras musculares lisas, mientras los NI-MTs principalmente colágeno. La densidad óptica integral (IOD) para colágeno fue 71.7 ± 14.2 en NI-MTs vs. 35.7 ± 11.4 en ID-MTs (t = 3.428, P = 0.027), y para músculo liso fue 12.8 ± 1.9 vs. 30.6 ± 8.9 (t = 3.369, P = 0.028), indicando que los ID-MTs pueden imitar la capa muscular lisa nativa.
La inmunofluorescencia de CD31 y α-SMA demostró neovascularización en MTs, con células CD31+ alrededor de estructuras vasculares α-SMA+. En contraste, las hADSCs mostraron vascularización mínima. La IHC confirmó mayor expresión de α-SMA y smoothelina en ID-MTs, manteniendo su diferenciación post-implantación.
Siembra de Células Uroteliales
Las UCs formaron una monocapa en la superficie de las estructuras, confirmada por tinción de citoqueratinas AE1/AE3, sugiriendo que los andamios bioimpresos soportan la adhesión y crecimiento de células uroteliales, esenciales para una barrera funcional.
Discusión
Los resultados demuestran el potencial de combinar bioimpresión 3D e ingeniería tisular para crear parches urinarios. Los ID-MTs ofrecen ventajas como viabilidad celular mejorada, vascularización y capacidad de mimetizar la capa muscular lisa nativa. La mayor expresión de VEGFA y TSG-6 en MTs sugiere promoción de vascularización y reducción de inflamación, críticas para el éxito de constructos tisulares.
El mantenimiento del fenotipo de músculo liso en ID-MTs post-implantación aborda un desafío común en ingeniería tisular: la pérdida de diferenciación durante la integración del andamio. La siembra exitosa de UCs apoya la factibilidad de este enfoque.
Conclusión
Este estudio presenta una técnica novedosa para fabricar parches de tracto urinario mediante bioimpresión 3D y MTs encapsulados. Los ID-MTs derivados de hADSCs pueden imitar la capa muscular lisa, promover vascularización y soportar adhesión urotelial. Este enfoque representa una solución prometedora para reconstrucción urinaria, requiriendo mayor investigación en modelos animales para evaluar su eficacia in vivo.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000654