El ARN largo no codificante PVT1 exacerba la lesión de cardiomiocitos inducida por hipoxia a través del eje miR-135a-5p/FOXO1
El infarto de miocardio (IM) sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad global, principalmente debido a la lesión prolongada de los cardiomiocitos inducida por isquemia. La hipoxia, un rasgo patológico crítico del IM, desencadena estrés oxidativo, apoptosis y disfunción mitocondrial en los cardiomiocitos. Si bien los ARN largos no codificantes (lncRNA) han surgido como reguladores clave de las enfermedades cardiovasculares, su papel en la lesión miocárdica inducida por hipoxia sigue poco explorado. Este estudio dilucida el papel mecanicista del lncRNA plasmacytoma variant translocation 1 (PVT1) en la lesión inducida por hipoxia en cardiomiocitos H9c2 de rata, identificando su interacción con el microARN-135a-5p (miR-135a-5p) y la regulación descendente del factor de transcripción forkhead box O1 (FOXO1).
La hipoxia induce la regulación al alza de PVT1 en cardiomiocitos H9c2
Para modelar la lesión hipóxica, las células H9c2 se expusieron a un ambiente hipóxico (1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂) durante 3–24 horas. La hipoxia redujo significativamente la viabilidad celular de manera dependiente del tiempo, disminuyendo al 52% a las 12 horas y al 38% a las 24 horas en comparación con controles normóxicos (P < 0,05). La apoptosis, evaluada mediante tinción con Annexina V/IP y citometría de flujo, aumentó del 5,8% en normoxia al 29,4% tras 12 horas de hipoxia (P < 0,05). El análisis por Western blot confirmó niveles elevados de la proteína proapoptótica Bax (aumento de 2,8 veces) y reducción de la antiapoptótica Bcl-2 (60% menos) bajo hipoxia. Notablemente, la expresión de PVT1, cuantificada por qRT-PCR, aumentó 3,5 veces en células hipóxicas, sugiriendo su papel potencial en la lesión hipóxica.
El silenciamiento de PVT1 atenúa la apoptosis inducida por hipoxia
Para investigar el rol funcional de PVT1, las células H9c2 se transfectaron con ARN corto en horquilla dirigido a PVT1 (shPVT1), logrando una reducción del 65% en los niveles de ARNm de PVT1 (P < 0,05 vs. controles). El silenciamiento de PVT1 restauró la viabilidad celular al 78% (vs. 52% en células hipóxicas tratadas con shControl) y redujo la apoptosis al 12,3%. Los análisis por Western blot reflejaron estos hallazgos: los niveles de Bax disminuyeron un 50%, mientras que Bcl-2 aumentó 1,8 veces en células transfectadas con shPVT1. Estos datos demuestran que PVT1 exacerba la lesión de los cardiomiocitos inducida por hipoxia.
PVT1 actúa como esponja para miR-135a-5p
Mediante análisis bioinformático (LncBase Predicted v.2), se identificó a miR-135a-5p como un miRNA potencialmente interactuante con PVT1. Ensayos de reportero de luciferasa confirmaron su unión directa: la co-transfección de miméticos de miR-135a-5p con PVT1 de tipo silvestre (PVT1-WT) redujo la actividad de luciferasa en un 40% (P < 0,05), mientras que mutaciones en el sitio de unión (PVT1-MT) abolieron este efecto. Ensayos de inmunoprecipitación de ARN (RIP) con anticuerpo anti-Ago2 mostraron un enriquecimiento de 4,2 veces para PVT1 y 3,8 veces para miR-135a-5p en fracciones unidas a Ago2 vs. controles IgG, confirmando su interacción en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC).
La sobreexpresión de PVT1 (mediante pcDNA3.1/PVT1) redujo los niveles de miR-135a-5p en un 55%, mientras que el silenciamiento de PVT1 aumentó su expresión 2,1 veces (P < 0,05). La hipoxia misma suprimió la expresión de miR-135a-5p en un 60%, posicionando a PVT1 como un regulador negativo de miR-135a-5p bajo estrés hipóxico.
La sobreexpresión de miR-135a-5p mitiga la lesión hipóxica
La transfección de miméticos de miR-135a-5p en células H9c2 hipóxicas aumentó sus niveles 3,3 veces, restaurando la viabilidad al 85% y reduciendo la apoptosis al 14,6% (P < 0,05 vs. NC-miRNA). Por el contrario, la inhibición de miR-135a-5p elevó la apoptosis hipóxica al 34,7%. La co-transfección de vectores de sobreexpresión de PVT1 con miméticos de miR-135a-5p revirtió estos efectos protectores, reduciendo la viabilidad al 63% y aumentando la apoptosis al 25,8%, confirmando la dependencia de PVT1 en la regulación de miR-135a-5p.
FOXO1 es un blanco directo de miR-135a-5p
TargetScan predijo a FOXO1, un factor de transcripción vinculado a apoptosis y estrés oxidativo, como blanco de miR-135a-5p. Los ensayos de luciferasa validaron esta interacción: los miméticos de miR-135a-5p redujeron la actividad de FOXO1-WT en un 45% (P < 0,05), mientras que FOXO1-MT (sitio de unión mutado) no fue afectado. La hipoxia aumentó los niveles de FOXO1 2,5 veces, efecto atenuado por miméticos de miR-135a-5p (reducción del 60%) y exacerbado por inhibidores de miR-135a-5p (aumento de 1,8 veces). Estos hallazgos establecen a FOXO1 como un blanco de miR-135a-5p regulado negativamente durante la hipoxia.
El eje PVT1/miR-135a-5p regula la apoptosis mediada por FOXO1
El silenciamiento de FOXO1 (shFOXO1) en células H9c2 hipóxicas redujo la apoptosis al 11,2% y restauró la viabilidad al 82%, replicando los efectos de la sobreexpresión de miR-135a-5p. La co-transfección de shFOXO1 con inhibidores de miR-135a-5p revirtió esta protección, aumentando la apoptosis al 28,5%. La sobreexpresión de PVT1 incrementó FOXO1 2,2 veces, mientras que su silenciamiento redujo FOXO1 un 50% (P < 0,05). Críticamente, los efectos proapoptóticos de PVT1 se abolieron mediante shFOXO1: en células que sobreexpresan PVT1, shFOXO1 restauró la viabilidad al 80% y redujo la apoptosis al 13,4%, confirmando a FOXO1 como efector descendente del eje PVT1/miR-135a-5p.
Implicaciones mecanicistas y terapéuticas
Este estudio describe una nueva vía en la lesión hipóxica de cardiomiocitos: la hipoxia regula al alza a PVT1, que secuestra miR-135a-5p, aliviando su represión sobre FOXO1. El FOXO1 elevado promueve apoptosis mitocondrial mediante regulación al alza de Bax y supresión de Bcl-2. El eje PVT1/miR-135a-5p/FOXO1 representa un nodo regulatorio crítico, ofreciendo posibles blancos terapéuticos. Por ejemplo, inhibidores de PVT1 o miméticos de miR-135a-5p podrían mitigar la apoptosis mediada por FOXO1, preservando la viabilidad de los cardiomiocitos post-IM.
Validación experimental y rigor técnico
Los experimentos clave incluyeron:
- Ensayo CCK-8: Cuantificó la viabilidad tras hipoxia y manipulaciones genéticas.
- Citometría de flujo: Midió apoptosis mediante tinción dual Annexina V/IP.
- qRT-PCR: Validó niveles de ARNm de PVT1, miR-135a-5p y FOXO1, normalizados a GAPDH o U6.
- Western blot: Evaluó expresión de proteínas Bax, Bcl-2 y FOXO1.
- Reportadores de luciferasa dual: Confirmaron interacciones miRNA-ARNm.
- Inmunoprecipitación de ARN (RIP): Verificó la unión PVT1/miR-135a-5p en RISC.
Los análisis estadísticos emplearon pruebas t de Student o ANOVA, considerando significativo P < 0,05.
Conclusión
Este estudio establece al lncRNA PVT1 como un inductor hipóxico de la apoptosis en cardiomiocitos mediante secuestro de miR-135a-5p y activación de FOXO1. Los hallazgos iluminan la interrelación fisiopatológica entre ARN no codificantes y factores de transcripción en el IM, proporcionando bases para terapias dirigidas a ARN que mejoren la cardiopatía isquémica.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001147