DnaJA4 participa en las respuestas a la hipertermia regulando la expresión de F-actina en células HaCaT
Introducción
La actina es una proteína multifuncional altamente conservada presente en prácticamente todas las células eucariotas, con una masa aproximada de 42 kDa. Existe en dos formas: actina globular (G-actina), que es un monómero esférico, y actina filamentosa (F-actina), un polímero de actina esférica que constituye el principal componente del citoesqueleto. Estas dos formas pueden convertirse reversiblemente entre sí bajo ciertas condiciones fisiológicas, pero solo la F-actina posee actividad funcional. La actina participa en procesos celulares críticos, como el establecimiento y mantenimiento de uniones y forma celular, migración, señalización, fagocitosis, apoptosis y proliferación.
Las proteínas de choque térmico (HSPs, por sus siglas en inglés) son proteínas de respuesta aguda altamente conservadas, con diversidad entre especies. Su expresión aumenta bajo estrés, como hipertermia o radiación ultravioleta B. Entre estas, las DnaJ/HSP40s, con peso molecular cercano a 40.000 Da, actúan como co-chaperonas de HSP70 para proteger células dañadas. La hipertermia, definida como exposición a 40-44°C durante 30-60 minutos, se utiliza en el tratamiento de enfermedades como cáncer de mama y pulmón no microcítico. Clínicamente, la hipertermia local a 44°C durante 30 minutos ha demostrado mayor eficacia que terapias convencionales en verrugas plantares.
Estudios previos revelaron que la expresión de DnaJA4 en células HaCaT aumenta tras hipertermia, afectando la inmunidad antiviral. La eliminación de DnaJA4 (KO) combinada con hipertermia potencia esta respuesta. Análisis de espectrometría de masas mostraron que DnaJA4 interactúa con proteínas del citoesqueleto, como tubulina y actina, bajo hipertermia. Este estudio examinó los efectos de DnaJA4 sobre la F-actina en células HaCaT durante la respuesta a hipertermia.
Métodos
Líneas celulares y cultivo
Células HaCaT salvajes (WT) se adquirieron de GENE (Shanghái, China). Las células DnaJA4-KO se generaron mediante tecnología CRISPR/Cas9. Se cultivaron en medio DMEM con glucosa alta, suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina, en incubadora a 37°C con 5% CO₂.
Tratamiento de hipertermia
Células en placas de 60 mm o pozos de 12 se expusieron a 44°C (±0,1°C) en baño termostatizado durante 30 minutos. Posteriormente, se recuperaron a 37°C y se recolectaron a las 6, 12 y 24 horas para análisis.
Tinción de F-actina
Cubreobjetos se trataron con etanol al 70%, lavaron con PBS y colocaron en placas de 12 pozos. Tras hipertermia, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y tiñeron con faloidina conjugada a Alexa Fluor 488. Los núcleos se contrastaron con DAPI y se visualizaron mediante microscopía confocal.
Citometría de flujo
Células WT y DnaJA4-KO se tripsinizaron, fijaron y marcaron con anticuerpos primarios anti-F-actina y secundarios conjugados a Alexa Fluor 488. Se analizaron en citómetro BD LSRFortessa, registrando al menos 10.000 células.
Western blot
Proteínas celulares se lisaron, cuantificaron y separaron mediante SDS-PAGE. Se transfirieron a membranas y se incubaron con anticuerpos contra F-actina, RhoA, ROCK1, E-cadherina, β-catenina y GAPDH. Los anticuerpos secundarios fueron conjugados con peroxidasa de rábano picante.
Resultados
Cambios morfológicos inducidos por DnaJA4-KO e hipertermia
En condiciones basales, las células WT presentaron filopodios abundantes y crecimiento disperso, mientras que las DnaJA4-KO mostraron conexiones intercelulares más compactas. Tras hipertermia, las WT se retraían a las 6 h, recuperando morfología normal a las 24 h, con aumento de filopodios a las 12 h. Las DnaJA4-KO no mostraron cambios significativos en el citoesqueleto de actina postratamiento.
Regulación de F-actina por DnaJA4-KO
La citometría reveló mayor intensidad fluorescente media en células DnaJA4-KO (6364,33 ± 989,10 vs. 4272,67 ± 918,50; P = 0,014), indicando sobreexpresión de F-actina. El Western blot mostró en WT una disminución de F-actina a las 6 h post-hipertermia, recuperándose parcialmente a las 24 h. En DnaJA4-KO, la F-actina superó los niveles basales a las 24 h (0,51 ± 0,02 vs. 0,44 ± 0,01; P = 0,001).
Las proteínas RhoA y ROCK1 siguieron patrones similares a F-actina, con mayor expresión en DnaJA4-KO. La E-cadherina disminuyó a las 24 h en ambos grupos, pero fue más elevada en células KO. La β-catenina no mostró cambios significativos.
Discusión
La hipertermia induce despolimerización inicial de F-actina, seguida de reensamblaje mediado por HSPs como Hsp27. Nuestros resultados coinciden con este modelo dinámico. La mayor agregación de F-actina en células DnaJA4-KO sugiere que DnaJA4 regula negativamente su expresión durante el estrés térmico.
La vía RhoA/ROCK1, clave en la regulación del citoesqueleto, mostró correlación con los niveles de F-actina, indicando que DnaJA4 modula esta ruta. Estudios previos vinculan la hipertermia con senescencia celular y activación de NF-kB, proceso exacerbado en células DnaJA4-KO. La reducción de filopodios en estas células podría afectar la internalización viral, hipótesis que requiere validación.
La menor expresión de E-cadherina post-hipertermia, más marcada en WT, sugiere que DnaJA4 podría influir en la adhesión y proliferación celular mediante este mecanismo. Estudios futuros deberán explorar esta relación y el papel de DnaJA4 en apoptosis.
Conclusión
DnaJA4 regula la expresión de F-actina y proteínas de la vía RhoA/ROCK1 en respuesta a hipertermia en células HaCaT. La generación de modelos de sobreexpresión de DnaJA4 permitirá profundizar en estos mecanismos.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001064