Clonación, expresión y caracterización inmunológica de dos nuevas profilinas de Artemisia annua
El rápido aumento de la incidencia de enfermedades alérgicas en las últimas décadas se ha convertido en un problema de salud pública global, afectando tanto a países desarrollados como en desarrollo. En China, el polen de especies de Artemisia, especialmente Artemisia annua y Artemisia vulgaris, se ha identificado como uno de los alérgenos ambientales más relevantes. Según el primer estudio nacional de polen realizado en todas las provincias de China, el polen de Artemisia es una causa principal de asma estacional. Entre las especies, A. vulgaris predomina en regiones occidentales, mientras que A. annua es abundante en las densamente pobladas zonas norte y este. Los anticuerpos de inmunoglobulina E (IgE) desempeñan un papel central en las enfermedades alérgicas. Estos anticuerpos son sintetizados por células B y se unen a receptores de alta afinidad en mastocitos o basófilos. Tras la exposición a alérgenos, estas células efectoras liberan mediadores inflamatorios, desencadenando respuestas alérgicas. La inmunoterapia con alérgenos, que implica la administración controlada de alérgenos específicos, se considera un tratamiento prometedor. Por ello, la identificación de alérgenos ligantes de IgE es crucial para mejorar el diagnóstico y las aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, estudios previos se han centrado principalmente en alérgenos del polen de A. vulgaris, como Art v 1–6. En contraste, solo dos alérgenos de A. annua han sido identificados: Art an 1 (una proteína tipo defensina) y Art an 7 (una galactosa oxidasa putativa), lo que subraya la necesidad de estudiar más a fondo los alérgenos de esta especie.
En este estudio, se identificaron dos nuevas profilinas de A. annua mediante secuenciación de próxima generación y la herramienta BLAST. Los ADN complementarios (ADNc) que codifican las profilinas 1 y 2 se amplificaron por PCR utilizando cebadores diseñados a partir de secuencias de regiones no codificantes obtenidas mediante secuenciación transcriptómica. Ambas profilinas presentaron marcos abiertos de lectura de 399 pares de bases, codificando 133 aminoácidos. Las secuencias se depositaron en GenBank con los números de acceso MN105099 y MN105100. Curiosamente, las secuencias aminoacídicas de las profilinas 1 y 2 fueron idénticas a las de Art v 4.0101 y Art v 4.0201 de A. vulgaris, respectivamente. Además, mostraron una identidad de secuencia del 65% al 90% con otras profilinas de polens vegetales. El análisis filogenético reveló que la profilina 1 forma un grupo cercano a Amb a 8, mientras que la profilina 2 se relaciona con Hel a 2, agrupándose todas en un mismo clado evolutivo.
Para aislar los alérgenos recombinantes, los genes de las profilinas se clonaron en el vector pET-28a y se expresaron en Escherichia coli BL-21. Ambas se expresaron como cuerpos de inclusión, purificados mediante cromatografía de afinidad con níquel bajo condiciones desnaturalizantes. La electroforesis SDS-PAGE mostró una banda única de ~12 kDa, confirmando la pureza de las proteínas replegadas.
La actividad ligante de IgE se evaluó en 200 pacientes alérgicos al polen de Artemisia y 16 controles sanos. Los resultados de ELISA mostraron reactividad IgE contra la profilina 1 en 65 pacientes (32.5%) y contra la profilina 2 en 54 (27%), tasas similares a las de profilinas como Bet v 2 (22%) y Hel a 2 (30.5%). El Western blot confirmó esta reactividad en 7/8 muestras para profilina 1 y 5/8 para profilina 2. Algunas muestras positivas en ELISA no mostraron bandas, posiblemente debido a la pérdida de epítopos conformacionales durante la desnaturalización.
En experimentos de inhibición competitiva, las tasas promedio de inhibición de las profilinas 1 y 2 frente al extracto crudo de polen fueron 23.6% y 18.6%, respectivamente. Además, se observó una reactividad cruzada del 54.57% (profilina 1 inhibiendo IgE contra profilina 2) y 39.35% (viceversa), indicando una importante similitud estructural.
No se encontraron diferencias significativas en la reactividad inmunológica entre pacientes con distintos síntomas clínicos (asma, rinitis, eczema, etc.), sugiriendo que la sensibilización a estas profilinas no está asociada a manifestaciones específicas en la población china, concordando con estudios previos.
En resumen, este estudio identifica dos nuevas profilinas de A. annua con secuencias idénticas a las de A. vulgaris, pero diferencias en regiones no codificantes. Su alta identidad con profilinas de otras especies podría explicar sensibilizaciones cruzadas. Las tasas de unión a IgE son comparables a las de otros alérgenos reportados, y su reactividad disminuyó con la edad en pacientes chinos, hallazgo que requiere validación en otras poblaciones. Estas profilinas representan herramientas valiosas para el diagnóstico molecular de alergias.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001309