1α,25-Dihidroxivitamina D3 inhibe la transición epitelial-mesenquimal inducida por el factor de crecimiento transformante β1 mediante la vía de β-catenina
Introducción
La transición epitelial-mesenquimal (TEM) es un proceso biológico en el que las células epiteliales pierden sus características fenotípicas y adquieren propiedades mesenquimales. Esta transformación se asocia con la pérdida de marcadores epiteliales como E-cadherina y la expresión de marcadores mesenquimales como α-actina de músculo liso (α-AMA) y fibronectina (FN). La TEM desempeña un papel crítico en condiciones patológicas, incluido el remodelado de las vías respiratorias en el asma, caracterizado por engrosamiento de la membrana basal, hiperplasia del músculo liso y fibrosis, factores que contribuyen a la cronicidad de la enfermedad.
El factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) es una citocina multifuncional clave en la inducción de TEM. Activa diversas vías de señalización, como Smad, no-Smad y β-catenina, siendo esta última particularmente relevante en el contexto del remodelado de vías aéreas. La vía Wnt/β-catenina regula procesos como proliferación celular, migración y diferenciación, y su desregulación se vincula con patologías como cáncer y fibrosis.
La vitamina D, específicamente su metabolito activo 1α,25-dihidroxivitamina D3 (1α,25(OH)2D3), exhibe efectos antifibróticos e inmunomoduladores. Estudios recientes sugieren que 1α,25(OH)2D3 inhibe la TEM inducida por TGF-β1, aunque los mecanismos exactos no están claros. Este estudio explora el papel de 1α,25(OH)2D3 en la regulación de la TEM en células epiteliales alveolares, enfocándose en la vía Wnt/β-catenina.
Métodos
Cultivo celular y tratamientos
Células epiteliales alveolares de ratas se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina. Tras alcanzar 80% de confluencia, se sometieron a privación de suero y fueron tratadas con 1α,25(OH)2D3, ICG-001 (inhibidor selectivo de la actividad transcripcional de β-catenina) o su combinación, seguidas de estimulación con TGF-β1. Los cambios morfológicos se observaron mediante microscopía de fluorescencia invertida.
Western Blot
Se analizaron los niveles de E-cadherina, α-AMA, FN y β-catenina. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas PVDF. Se utilizaron anticuerpos primarios específicos y secundarios conjugados con peroxidasa, detectándose mediante quimioluminiscencia.
Inmunofluorescencia
Células fijadas con paraformaldehído al 4% se permeabilizaron con Tritón X-100 y se incubaron con anticuerpos contra β-catenina, E-cadherina, α-AMA y FN, seguidos de tinción secundaria fluorescente. Los núcleos se contrastaron con DAPI.
RT-qPCR en tiempo real
El ARN total se extrajo con TRIzol® y se sintetizó ADNc. Se amplificaron transcritos de Snail y β-actina (control interno) mediante cebadores específicos, utilizando el método 2−ΔΔCt para análisis cuantitativo.
Zimografía de gelatina
La actividad de MMP-9 se evaluó mediante electroforesis en geles de gelatina. Tras incubación con buffer de sustrato, las zonas de degradación se visualizaron con azul de Coomassie.
Ensayo Top/Fop Flash
Se transfectaron plásmidos reporteros Top/Fop Flash usando Lipofectamina 2000. La actividad de luciferasa se midió tras 48 horas, normalizándose con Renilla.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron con ANOVA unidireccional seguido de la prueba LSD (SPSS v22.0), considerándose significativo p <0.05.
Resultados
1α,25(OH)2D3 e ICG-001 inhiben la TEM inducida por TGF-β1
El TGF-β1 indujo cambios morfológicos hacia fenotipo mesenquimal, reversibles con 1α,25(OH)2D3 o ICG-001. El western blot mostró que TGF-β1 redujo E-cadherina y aumentó α-AMA/FN, efectos contrarrestados por los tratamientos, siendo más pronunciada la inhibición con la combinación. La inmunofluorescencia corroboró la reducción de marcadores mesenquimales.
Regulación negativa de la vía Wnt/β-catenina
El ensayo Top/Fop Flash reveló que TGF-β1 incrementó la actividad transcripcional de β-catenina, inhibida por 1α,25(OH)2D3 e ICG-001. El western blot confirmó la disminución de β-catenina tras los tratamientos.
Inhibición de factores descendentes: MMP-9 y Snail
La RT-qPCR demostró que TGF-β1 elevó la expresión de Snail, efecto bloqueado por los tratamientos. La zimografía mostró disminución de actividad MMP-9 con 1α,25(OH)2D3 e ICG-001.
Discusión
Este estudio demuestra que 1α,25(OH)2D3 inhibe la TEM inducida por TGF-β1 mediante la regulación negativa de la vía Wnt/β-catenina. La combinación con ICG-001 potencia este efecto, sugiriendo sinergia terapéutica. La supresión de Snail y MMP-9 explica la inhibición del remodelado, destacando el potencial de la vitamina D como estrategia antifibrótica en asma. Futuros estudios in vivo validarán estas observaciones.
Conclusión
1α,25(OH)2D3 inhibe la TEM en células epiteliales alveolares mediante modulación de la vía Wnt/β-catenina, mostrando sinergia con ICG-001. Estos hallazgos respaldan el uso de vitamina D como agente terapéutico en el remodelado de vías aéreas en asma.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000830